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磷脂酶固定化載體材料的研究進展

發布日期:2019-09-30 作者: 點擊:

磷脂酶固定化載體材料的研究進展


鮑 賽1,2,操麗麗1,2,龐 敏1,2,潘麗軍1,2,侯志剛1,2,
水龍龍1,2,李進紅1,2,姜紹通1,2
(1.合肥工業大學 食品科學與工程學院,合肥 230009; 2.安徽省農產品精深加工重點實驗室,合肥 230009)


摘要:游離磷脂酶價格昂貴且穩定性差限制了其應用,固定化技術使酶穩定性增強,可以反復使用,降低了成本,極大地拓寬了酶的應用范圍。性能優良的固定化酶應具備成本低、穩定性高和催化活性高等特性。載體材料不僅是固定化酶的重要組成部分,還是影響固定化酶性能的因素之一。對磷脂酶固定化載體材料主要從無機材料、有機材料、復合材料以及無載體4個方面進行綜述,并對磷脂酶固定化載體材料發展方向予以展望,為固定化磷脂酶研究在載體材料上的選擇提供了參考依據。
關鍵詞:磷脂酶;固定化;載體;材料
中圖分類號:Q814.2;Q55    文獻標識碼:A        文章編號:1003-7969(2018)12-0050-05


Progress in carrier materials for immobilization of phospholipase
BAO Sai1,2, CAO Lili1,2, PANG Min1,2, PAN Lijun1,2,HOU Zhigang1,2,
SHUI Longlong1,2, LI Jinhong1,2, JIANG Shaotong1,2
(1.School of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China;
2.Key Laboratory for Agriculture Products Processing of Anhui Province, Hefei 230009, China)


Abstract:Expensive price and instability of the soluble phospholipases limit their application. Immobilization technology enhances the stability of the enzyme. The repeated use of the immobilized enzyme decreases the cost and greatly broadens the scope of application of the enzyme. The immobilized enzyme with excellent performance should have the characteristics of low cost, high stability and high catalytic activity. The carrier material is not only an important part of the immobilized enzyme, but also one of the factors affecting the performance of the immobilized enzyme. The carrier materials of phospholipases immobilization, such as inorganic materials, organic materials, composite materials and no carrier were reviewed. The future prospects of carrier materials were also addressed with the aim to provide a certain reference in the choice of materials in immobilization of phospholipase. 
Key words:phospholipase; immobilization; carrier; material


  磷脂酶是一類存在于生物體內、能水解甘油磷脂的酶,在油脂中發揮重要作用。依據磷脂酶催化磷脂裂解位點的不同分為5類:磷脂酶A1,磷脂酶A2,磷脂酶B,磷脂酶C和磷脂酶D。然而,磷脂酶在自然界中含量低,價格高昂,在酸、堿、熱和有機溶劑中不穩定,且難以回收利用,限制了其在工業上的應用。磷脂酶的固定化成為改進這些不足的關鍵。
     所謂固定化,就是將水溶性酶通過物理或化學方法束縛或者包埋在水不溶性載體中[1]。固定化磷脂酶在保留了磷脂酶特有的高效性和專一性的同時,也提高了磷脂酶的穩定性,極大地降低了成本,工業化操作變得簡單,使大規模工業化應用成為現實[2]。
     載體不僅是固定化酶的重要組成部分,還是影響固定化酶性能的因素之一[3]。選擇適宜的載體有利于提高固定化酶的各種性能。關于載體材料的選擇,可以從以下幾點考慮:載體物化性質,如形狀、大小、孔徑、機械強度、耐酸堿、耐高溫和耐生物降解能力等;載體材料的獲得,載體材料廉價易得,是實現大規模工業化應用的關鍵;能否再生,對于價格昂貴的載體,再生利用能降低成本,環保節能等。合適的載體材料是酶固定化工藝研究的重點。本文對近幾年來磷脂酶固定化載體材料進行了綜述并予以展望。
1 無機載體材料
     無機材料是指能從自然界直接獲取的無機物或者混合其他物質制成的材料。無機材料具備廉價易得、機械強度大、耐酸堿、耐有機溶劑、耐微生物腐蝕等優點,但無機材料結構難以控制,與酶結合能力差。
     近幾年來,為獲得理想的無機載體材料,學者們通常會在無機材料表面修飾上活潑的功能基團或者利用新的固定化技術將磷脂酶固定在無機材料上。陶明等[4]使用硅烷偶聯劑KH550水溶液對無機材料凹凸棒土進行活化,活化后的凹凸棒土用于固定化磷脂酶A1,顯示出較好的酶活回收率和熱穩定性。Li等[5]利用新的固定化技術對磷脂酶進行固定化,先使用5%的大豆卵磷脂對磷脂酶A1進行生物印跡,再通過無機材料硅藻土對生物印跡后的磷脂酶A1固定化,固定化酶在卵磷脂-己烷溶液中的活性提高了30.9倍,顯著改善了磷脂酶A1在有機溶劑中的酶學性質。
     新型無機材料也成為固定化磷脂酶的考慮對象。新型無機材料是指近幾年開發的具有優異性能的無機材料,如無機納米材料、介孔分子篩。無機納米材料具備生物相容性良好、比表面積大等優點而成為固定化磷脂酶的優良載體材料[6]。其中,納米二氧化硅對大分子物質吸附能力強,且含有功能基團而受到廣泛關注。Li等[7]以納米二氧化硅為核心,通過吸附、沉淀和化學交聯等手段形成“酶網”覆蓋在其表面。固定化酶的酶活約為游離酶酶活的1.15倍。對固定化磷脂酶D酶學性質研究表明,與游離磷脂酶D相比,固定化磷脂酶D的熱穩定性明顯提高,pH適應性顯著增強,動力學研究表明固定化酶催化活性和酶與底物親和性增加。在4 ℃,固定化酶的半衰期為70 d,約為游離酶的2.3倍。在連續使用12批次后,固定化磷脂酶D的初始反應速率大于第一批次的50%,表明采用該材料固定化的磷脂酶D催化活性高,穩定性強。介孔分子篩憑借其內部孔徑可調、比表面積大和酶在孔道中易擴散等優點,成為固定化酶載體材料的熱點。介孔分子篩已被廣泛應用于固定化β-葡萄糖苷酶[8]、青霉素G酰化酶[9]等,但將其應用于固定化磷脂酶的研究仍處于空白。
2 有機載體材料
     有機載體材料是直接利用有機材料或對有機材料進行物理或化學改性制成的材料。有機材料包括天然高分子材料和合成高分子材料兩類。
2.1 天然高分子材料
     天然高分子材料來源于自然界中,是一種來源廣泛且取之不竭的可再生資源,具有無毒環保、容易改性和生物相容性良好等優點,常被作為固定化酶的載體材料。近年來,常用于磷脂酶固定化的天然高分子材料為天然多糖,如殼聚糖、纖維素和海藻酸鈉等。 
     殼聚糖化學性質穩定,耐熱性好,含大量活性基團氨基。孫萬成等[10]將殼聚糖、戊二醛與磷脂酶A1同時加入反應體系中,使載體、交聯劑和酶充分接觸,克服了傳統方法導致的酶活回收率偏低的缺陷。與此同時,固定化磷脂酶A1熱穩定性明顯提高,pH向堿性偏移,動力學反應表明固定化酶與底物親和力增強,有利于酶促反應。
     纖維素不易被微生物分解,且含有大量羥基,羥基能通過化學反應帶有多種活潑的官能團,而與酶上的官能團發生共價反應固定化酶。于殿宇等[11]以高碘酸鈉活化的纖維素濾紙膜固定化磷脂酶A1。與游離磷脂酶A1相比,固定化磷脂酶A1的pH耐受性和溫度穩定性增強。重復使用7次后,固定化磷脂酶A1催化活性仍有初始活性的65%以上。Fbd等[12]以三醋酸纖維素作為載體固定化磷脂酶,三醋酸纖維素比普通的纖維素更疏水,在脂肪酶固定化中表現出良好的性能,是固定化磷脂酶的良好候選載體材料。磷脂酶A1在三醋酸纖維素中的固定化率在60 min內達到97.1%,酶活為975.8 U/g。固定化后的磷脂酶A1具有良好的熱穩定性和pH穩定性。
     天然高分子材料安全無毒,符合綠色生產的要求,與酶結合能力良好,固定化條件溫和,操作簡易,具有廣闊的應用前景。天然高分子材料固定化磷脂酶已被成功應用于生產實踐中,如陳麗萍等[13]將海藻酸鈉固定的磷脂酶A1應用于大豆油脫膠,脫膠后測得大豆油中磷含量為9.87 mg/kg,符合油脂中低磷含量要求。
2.2 合成高分子材料
     合成高分子材料具備機械強度高、物理化學性質確定等優點而受到研究者們的喜愛。應用于磷脂酶固定化的合成高分子材料主要為合成樹脂類,合成樹脂大多通過簡單的吸附作用與磷脂酶結合,對酶結構的破壞較小。
     Liu等[14]以陰離子交換樹脂D202固定化磷脂酶A1,酶活達到1 682 U/g,酶活殘留率為33.0%。利用固定化酶催化大豆油甘油解生產功能性食用油甘油二酯(DAG),在45 ℃反應12 h,DAG產量為53.9%,與游離酶(54.7%)接近。固定化酶連續使用28批次后,DAG產量為31.8%,而游離酶在連續使用10次后,DAG產量僅21.9%。Li等[15]以D380樹脂對磷脂酶A1進行固定,得到的固定化酶活力為720.95 U/g。利用酯交換反應體系催化合成DHA/EPA型磷脂,固定化磷脂酶A1的催化效果遠高于游離磷脂酶A1。反應24 h后,以固定化磷脂酶A1作為催化劑,DHA/EPA總結合率為19.5%,然而以游離磷脂酶A1作為催化劑,DHA/EPA的總結合率僅為7.4%。固定化酶重復使用6次后,殘存的酶活力仍可達到48.9%。聚苯乙烯二乙烯苯樹脂[16]和D001樹脂[17]也被用于磷脂酶的固定化研究。
     以上結果表明,合成樹脂固定化磷脂酶催化活性優良,將其應用于生產實踐中,產品產量及固定化磷脂酶重復使用性均優于游離酶。此外,合成樹脂固定化磷脂酶還被用于大豆油脫膠[18]、催化制備果糖月桂酸單酯[19]、DHA型磷脂[20]、磷脂酰絲氨酸[21]、富含共軛亞油酸磷脂[22]等中。 
3 復合載體材料
     復合材料是一種混合物,由兩種或兩種以上材料通過物理或者化學手段組合而成。復合材料的性能不單是簡單地單一材料性能的相加,還可能通過復合效應產生原材料不具備的新性能。常見的固定化磷脂酶復合材料包括天然高分子復合材料、合成-天然高分子復合材料以及無機-有機復合材料。
3.1 天然高分子復合材料

     將天然高分子材料如海藻酸鈉、殼聚糖和明膠組合是常見的固定化磷脂酶材料,如海藻酸鈉和殼聚糖復合物固定化磷脂酶A1[23]、磷脂酶A2[24],海藻酸鈉和明膠復合物固定化磷脂酶A1[25],最大酶活回收率均大于60%,重復使用性優良。與游離磷脂酶相比,固定化后磷脂酶的熱、pH穩定性均得到提高。張智等[26]分別采用海藻酸鈉、海藻酸鈉-殼聚糖和海藻酸鈉-明膠為載體固定化磷脂酶A1。重復使用4次后,兩種復合材料固定化磷脂酶A1的相對酶活仍保留在80%左右,而以單一材料為載體固定化磷脂酶A1的相對酶活僅剩50%。研究表明,復合材料固定化磷脂酶的操作穩定性高于單一材料固定化磷脂酶。
     復合天然高分子材料提高了酶的穩定性和重復使用率,擴大了固定化磷脂酶的應用范圍。目前,復合天然高分子材料固定化磷脂酶主要用于油脂脫膠,如海藻酸鈉和殼聚糖的復合材料固定化磷脂酶用于大豆油脫膠[27]和菜籽油脫膠[28],海藻酸鈉和明膠的復合材料固定化磷脂酶用于冷榨菜籽油脫膠[29],脫膠效果均較好。
3.2 合成-天然高分子復合材料
     合成-天然高分子復合材料固定化磷脂酶,兼具合成高分子材料和天然高分子材料的優點。時敏等[30]將纖維素衍生物醋酸纖維素制成鑄膜液,涂在聚四氟乙烯基膜表面,得到復合膜固定化磷脂酶A1。聚四氟乙烯基膜為多孔狀結構,有利于酶分子的附著,醋酸纖維素提供活性基團。固定化磷脂酶A1的最大酶活力為4.0 U/cm2。Zhan等[31]將一定量的磷脂酶A1溶液加入充分溶解的海藻酸鈉和聚乙烯醇溶液中,然后注入硼酸和氯化鈣混合溶液中,浸泡若干分鐘,形成微球。聚乙烯醇提高了微球的機械強度,海藻酸鈉形成多孔結構有利于磷脂酶A1進入且能抑制微球聚集在一起。固定化磷脂酶A1最高酶活達到126.50 U/g,固定化效率達到8532%。重復使用8次后,固定化磷脂酶A1仍然保留了50.37%的初始酶活。在4 ℃儲存6周后,固定化磷脂酶A1酶活為初始酶活的78.58%。
     固定化酶的催化活性、重復使用性和操作穩定性都較好,且結合了兩種材料的優點,但目前對于合成-天然高分子材料固定化磷脂酶的研究較少。 
3.3 無機-有機復合載體材料
     無機-有機復合材料固定化磷脂酶,多采用有機高分子材料包裹無機納米粒子形成納米復合微球固定化磷脂酶。梁江[32]以殼聚糖包裹納米二氧化硅為載體固定化磷脂酶D,納米二氧化硅提供核,殼聚糖提供大量活性基團。固定化酶催化效率是游離酶的1.16倍,pH耐受性變寬;重復使用7次后,仍有60%的殘余酶活;保存70 d后,酶活剩余50%。
     復合納米微球催化活性、操作和儲藏穩定性均良好,但復合納米微球從反應體系中分離回收困難,易造成損失[33]。磁性納米微球由磁性納米粒子與有機材料復合而成。磁性納米粒子表面可通過包裹或接枝作用結合含多種功能基團的有機材料。通過外部磁鐵作用,固定化酶與反應體系能快速分離;撤除外部磁鐵,固定化酶能穩定懸浮在反應體系中。因此,磁性納米微球是良好的固定化酶材料[34]。
     Yu等[35]使用Fe3O4/SiOx-g-P(GMA)磁性納米微球固定化磷脂酶A1,掃描電子顯微鏡結果表明形成的納米微球直徑約為250 nm。在最優條件下,固定化效率為64.7%,酶活為2 066.67 U/g。與游離磷脂酶A1相比,固定化磷脂酶A1的pH和溫度穩定性更好。將固定化酶用于大豆油脫膠,脫膠7 h后,脫膠油中磷含量為9.6 mg/kg,低于傳統的水化脫膠(<10 mg/kg)。55 ℃脫膠10次后,殘余酶活為初始酶活的80%以上。Qu等[36]使用該載體固定化磷脂酶A2,得到的酶固載率及催化活性最大,分別為122.60 mg/g和1 289 U/g,用于大豆油脫膠,脫膠油磷含量為9.8 mg/kg,使用5次后,酶活損失較小。目前,磁性納米微球越來越受到國內外研究者的重視,如固定化堿性蛋白酶[37]、脂肪酶[38-39],但將磷脂酶固定在磁性納米粒子上的研究并不多見。
4 無載體——交聯酶聚集體(CLEAs)
     CLEAs不需要載體,操作簡單,酶活性中心未被破壞,酶活回收率極高,極具開發價值[40]。魚園[41]以磷脂酶D制備CLEAs,最大催化活性為1562 U/mg,酶活回收率為86%,重復使用10個批次后,酶活為初始酶活的55%。然而,無載體固定化酶難以回收、機械強度差,因此人們考慮對CLEAs進行改進。王妍等[42]將磷脂酶A1制備成CLEAs,然后使用海藻酸鈣凝膠進行包埋,增強了機械強度,克服了其不易回收的缺陷。固定化酶的耐熱性高于游離酶,且更耐堿;重復使用6個批次后,固定化酶酶活仍保持65%以上。
5 結束語
     對磷脂酶固定化載體材料的研究從未停止,由早期的單一材料發展到復合材料,由直接使用自然界的已有材料到對已有材料進行改性和使用新型材料,有效提高了磷脂酶的穩定性和催化活性,擴大了磷脂酶的應用范圍。對磷脂酶固定化載體材料的選擇,需要綜合考慮多方面因素,包括載體材料的來源、理化性質、應用環境等,優良的載體材料需要與酶及應用相匹配。隨著化工、材料和生物技術的發展,根據磷脂酶特性和固定化需要設計制備性能優良的載體將成為磷脂酶固定化材料的重要選擇方向,這需要研究者們更深入掌握磷脂酶的物化特性和應用環境。
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